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SABC(兔IgG)-FITC/POD雙標(biāo)免疫組化試劑盒*

更新時(shí)間:2018-08-14      瀏覽次數(shù):1519

SABC(兔IgG)-FITC/POD雙標(biāo)免疫組化試劑盒*!

 

產(chǎn)品名稱:         SABC(兔IgG)-FITC/POD雙標(biāo) kit
產(chǎn)品規(guī)格:         100-200T
產(chǎn)品貨號:         SA0025
產(chǎn)品單位:         盒
供貨商:    上海信帆生物

SABC(Strept Avidin-Biotin Complex)法是一種顯示組織和細(xì)胞中抗原分布的簡便而敏感的免疫組化染色方法。在實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中,其比直接酶標(biāo)二抗敏感5-10倍,是免疫組化的理想方法。     

 

基本原理     

SABC是鏈霉親和素-生物素-酶(或者FITC)復(fù)合物。     
親和素(Avidin)存在于雞蛋中,分子量67000,是一種堿性蛋白。對生物素有很強(qiáng)的結(jié)合力。鏈霉親和素是從鏈霉菌中提取的一種蛋白質(zhì),分子量47000,等電點(diǎn)為6.0-6.5,也對生物素有很強(qiáng)的結(jié)合力,但其等電點(diǎn)接近中性,明顯消除了原堿性蛋白所引起的非特異性吸附。     

 

生物素活化后,可以標(biāo)記抗體和酶而不影響其活性。再經(jīng)SABC放大,一分子的抗體可以結(jié)合幾十分子的酶或者熒光素,從而有很強(qiáng)的放大作用。     

 

SABC是專為免疫組化和其他免疫檢測而設(shè)計(jì)的,用以顯示組織和細(xì)胞中抗原分布。鏈霉親和素(StreptAvidin)是一種從鏈霉菌中提取的蛋白質(zhì),同親和素一樣,對生物素有*的親和力,親和素是一個(gè)堿性蛋白質(zhì)(IP=10),經(jīng)改造后可以轉(zhuǎn)變成中性蛋白質(zhì)。鏈霉親和素等電點(diǎn)接近中性,對組織和細(xì)胞的非特異吸附很低,基于鏈霉親和素的免疫組化方法背景很低。SABC即StreptAvidin—Biotin Complex。SABC大約可形成一百個(gè)左右的過氧化物酶和五十個(gè)左右的鏈霉親和素所構(gòu)成的復(fù)合物。大量的酶將保證SABC具有很高的敏感性。     
 

自備試劑:     
      
1.粘片劑多聚賴氨酸。     
      
2. 0.01 M PBS(pH7.2-7.4)     
      
3. 0.01M檸檬酸鈉緩沖液     
      
4、抗熒光衰減封片劑    

 

SABC(兔IgG)-FITC/POD雙標(biāo)免疫組化試劑盒*!

 

 
實(shí)驗(yàn)步驟:     
      
以石蠟切片熱修復(fù)為例     
      
1. 切片常規(guī)脫蠟至水。3%H2O2室溫5-10分鐘以滅活內(nèi)源性酶(如果FITC,剛可省掉此步)。蒸餾水洗3次。     
      
2.熱修復(fù)抗原:將切片浸入0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液(PH6.0),電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電,間隔5-10分鐘后,反復(fù)1-2次。冷卻后PBS(pH7.2-7.6)洗滌1-2次。     
      
3.滴加5%BSA封閉液,室溫20分鐘。甩去多余液體, 不洗。     
      
4.用稀釋液將一抗(如兔抗IL-10)按一定比例稀釋(稀釋后的一抗4℃可保存一周),也可另行購買抗體稀釋液。滴加稀釋的一抗,37 ℃ 1小時(shí)左右或20℃時(shí)2小時(shí)左右。也可4℃過夜。PBS(pH7.2-7.4)洗2分鐘×3次。(一抗的稀釋度、孵育時(shí)間和溫度與染色強(qiáng)度、背景有直接關(guān)系。一般來說,陽性染色強(qiáng)度不夠時(shí),可提高一抗?jié)舛群脱娱L孵育時(shí)間;背景過高時(shí),可降低一抗?jié)舛群涂s短孵育時(shí)間。)     
      
5.根據(jù)使用量,用稀釋液將生物素化二抗?jié)饪s液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul生物素化羊抗兔IgG濃縮液,混勻即成工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加生物素化羊抗兔IgG工作液,20-37℃ 30分鐘。PBS(pH7.2-7.4)洗2分鐘×3次。     
SABC(兔IgG)-FITC/POD雙標(biāo) kit     
如果想用熒光觀察,請接下面步驟,如果想用DAB顯色,請?zhí)^6-7。     
      
6.根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-FITC濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-FITC濃縮液,混勻即成SABC-FITC工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-FITC工作液,20-37℃,30分鐘(避光)。PBS(pH7.2-7.4)洗5分鐘×4次。     
      
7.滴加抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡觀察。     
      
如果想用DAB顯色,請接8。     
      
8.根據(jù)使用量,用稀釋液將SABC-POD濃縮液按1:100稀釋成工作液(1ml稀釋液加入10ul SABC-POD濃縮液,混勻即成SABC-POD工作液。此工作液4℃可保存一周).滴加SABC-POD工作液,20-37℃,30分鐘。PBS(pH7.2-7.4)洗5分鐘×4次。     
      
9.DAB顯色:根據(jù)用量,用PBS(pH7.2-7.4)配制,按1mlPBS加入50ul 20×DAB顯色液A,加入50ul 20×DAB顯色液B 。混勻后加至切片。室溫顯色, 鏡下控制反應(yīng)時(shí)間,一般在5-30分鐘之間。蒸餾水洗滌終止反應(yīng)。     
      
10.蘇木素輕度復(fù)染。脫水,透明,封片。顯微鏡觀察。     
對于細(xì)胞片,常規(guī)固定后,PBS漂洗兩次,再用0.5%Txiton X-100室溫20分鐘,PBS漂洗兩次,3%H2O2(如果FITC,剛可省掉此步)處理15分鐘;PBS漂洗兩次,下接上面第4步。     
對于冰凍切片,固定后,可用PBS漂洗兩次,再接上面第二步。

 

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