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辣根過氧化物酶實驗中為廣泛的標記用酶!

更新時間:2019-09-11      瀏覽次數:1182

辣根過氧化物酶實驗中為廣泛的標記用酶!

 

POD是一種具有氧化還原酶性質的血紅素蛋白。用于生化研究,是酶標記法所用的一種主要酶。也用于生物液體中 葡萄糖和半乳糖的測定

 

溶解性10 mg/mL in water 
來源From horseradish 
別名Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase;Horseradish peroxidase;HRP POD 
英文名稱Peroxidase(POD) 
CAS9003-99-0 
儲存條件-20℃ 
酶活/效價233-300units/mg solid 
外觀(性狀)褐色結晶性凍干粉狀
 
 

HRP是一種分子量達44 000的糖蛋白,由無色的酶蛋白和深棕色的鐵卟啉結合而成,中性糖和氨基糖約占18%,主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每一個HRP分子中含一個氯化血紅素IX作輔基,該輔基在403nm波長處有大吸收峰,而去輔基的酶蛋白在275nm波長處有大吸收。HRP在403nm的OD值與275nm的OD值之比,也就是所謂的RZ(Reinheits Zahl)值。

RZ值僅說明血紅素基團在HRP中的含量,并非表示HRP制劑的真正純度,而且RZ值高的HRP制劑,并不意味著酶活性也高。但可以一純酶溶液在10mm光徑403nm波長下的吸光度來計算酶濃度[1%(W/V)酶溶液吸光度為22.5,濃度為227umol/L]。HRP干燥貯存于–20oC可保持穩定,使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸鈉、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L細胞色素C(pH 7.4)溶液作為基質冷凍保存,可使酶結合物穩定數年。

HRP對熱及有機溶劑的作用比較穩定,用甲苯與石蠟切片處理或用純乙醇或l0%甲醛水溶液固定做冷凍切片,均不能使其活性改變。氰hua物或硫化物在10–5~10–6mol/L濃度時具有可逆性地抑制HRP的作用;氟化物、疊氮化合物或羥胺僅在高于10-3mol/L濃度時抑制HRP;HRP還可被羥甲基過氧化氫不可逆地抑制。強酸也是HRP的強烈的抑制劑。

因此,在酶免疫測定常選用上述的某些化合物如氟化鈉、疊氮鈉和強酸等作為酶反應的終止劑。此外,在配制酶免疫測定的稀釋緩沖液時,為防止酶失活,應避免使用疊氮鈉作防腐劑。HRP的同工酶主要可分為三種類型:

①含糖量高的酸性同工酶。

②等電點接近于中性(或微堿)的含糖量相對較低的同工酶。

③含糖量低的堿性(PI>11)同工酶。酶免疫試驗中所使用的HRP,以PI為8.7~9.0的所謂“C”同工酶為主要組成成分,其他同工酶的活性則很低。“C”同工酶的共價結構由2個密切接近的區域組成,血紅素基團則位于其間而成夾心結構,糖鏈以8個不同的部位結合于多肽。天然的酶所帶的純電荷極少;無游離的。—氨基,僅有2個可測出的組氨酸,6個賴氨酸似乎全被糖鏈外殼所遮蓋。因此,HRP一般僅有1~2個可用于耦聯的氨基。

 

HRP之所以是迄今為止在ELISA中應用為廣泛的標記用酶,主要是因為其一方面易于提取,價格相對低廉;另一方面性質穩定,耐熱及有機溶劑的作用,與抗原或抗體偶聯后,活性很少受損失。

 

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