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BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒樣本準(zhǔn)備要求

更新時(shí)間:2023-01-06      瀏覽次數(shù):836

BrdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒樣本準(zhǔn)備要求


描述:BrdU檢測(cè)試劑盒用于細(xì)胞和組織切片的細(xì)胞增殖檢測(cè)。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine),即5-溴脫氧尿嘧-啶核苷,是胸腺嘧啶核苷(T)類似物,檢測(cè)原理為BrdU可以通過競(jìng)爭(zhēng)替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當(dāng)處于旺盛分裂的細(xì)胞摻入BrdU后,利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng),即可檢測(cè)出含有BrdU的細(xì)胞,結(jié)合其它細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行雙重標(biāo)記,可判斷出增殖細(xì)胞的種類、增殖速度等,對(duì)研究細(xì)胞動(dòng)力學(xué)有重要意義。BrdU經(jīng)活體注射或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)進(jìn)入組織細(xì)胞,摻入DNA定位準(zhǔn)確,可有效反應(yīng)S期細(xì)胞新合

成DNA的水平,而且受細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境影響小,標(biāo)記不會(huì)丟失。


細(xì)胞樣品:

1. 細(xì)胞準(zhǔn)備:提前準(zhǔn)備細(xì)胞爬片,確保細(xì)胞狀態(tài)正常,貼壁良好;

2. BrdU孵育:細(xì)胞經(jīng)含BrdU的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光孵育一定時(shí)間,BrdU濃度及細(xì)胞孵育時(shí)間依據(jù)細(xì)胞種類不同,建議預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳條件。注意事項(xiàng)中已測(cè)試細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件可供參考;

3. 細(xì)胞固定:上述經(jīng)BrdU孵育的細(xì)胞爬片,PBS洗3次,每次5min。向孔板內(nèi)加入1mL 4%多聚甲醛覆蓋細(xì)胞,室溫固定20-30min。PBS洗3次,每次5min;

4. 通透:向孔板內(nèi)滴加破膜液覆蓋細(xì)胞處理8-10min,PBS洗3次,每次5min;

5. 細(xì)胞核染色(可選):

若后續(xù)白光檢測(cè),則用蘇木素染細(xì)胞核:向孔板內(nèi)滴加蘇木素染液室溫染色5min,吸棄蘇木素染液,PBS洗3次,每次5min;

若后續(xù)熒光檢測(cè),則用DAPI染細(xì)胞核:向孔板內(nèi)滴加DAPI染液室溫染色5min,吸棄DAPI染液,PBS洗3次,每次5min;

6. 再固定:向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min,PBS洗3次,每次5min;

7. 酸化:向孔板內(nèi)滴加1M HCl覆蓋細(xì)胞,37℃處理10min,PBS洗3次,每次5min;

8. 后固定:再次向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min,PBS洗3次,每次5min;

9. 封閉:向孔板內(nèi)滴加封閉液(3% BSA)室溫孵育30min。吸棄封閉液,不要清洗;

10. Anti-BrdU抗體孵育:向孔板內(nèi)滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細(xì)胞,4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液,PBS洗3次,每次5min;

11. 二抗孵育:向孔板內(nèi)滴加二抗工作液覆蓋細(xì)胞,室溫孵育1h。吸棄二抗工作液,PBS洗3次,每次5 min。注意,若是用熒光標(biāo)記的二抗,孵育及洗滌時(shí)均需避光;


結(jié)果觀察

如果用HRP標(biāo)記的二抗檢測(cè),細(xì)胞核呈深藍(lán)色,增殖細(xì)胞呈棕色。如果是熒光標(biāo)記的二抗,細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光(Ex=358 nm,Em=461 nm),增殖細(xì)胞為對(duì)應(yīng)二抗的熒光。

注意事項(xiàng)

1. 對(duì)于細(xì)胞爬片樣品,BrdU的使用濃度和處理時(shí)間與細(xì)胞種類有關(guān)。一般來說,處理腫瘤細(xì)胞所需濃度和時(shí)間都較低,成纖維細(xì)胞或上皮細(xì)胞等增殖較慢的細(xì)胞需要提高濃度并延長(zhǎng)作用時(shí)間,建議濃度范圍為20-100μM,作用時(shí)間為40min-4h,可根據(jù)具體細(xì)胞的種類進(jìn)行摸索調(diào)整。

下表為測(cè)試的常用細(xì)胞處理濃度及時(shí)間,僅供參考。


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